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CHO 殘留 DNA 檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法)試劑盒簡(jiǎn)介：

CHO 殘留DNA 檢測(cè)試劑盒是用于定量檢測(cè)各種生物制品及藥品的中間品、半成品和成 品中殘留的 CHO  宿主細(xì)胞 DNA。
本試劑盒利用 Taqman 探針法， 定量檢測(cè)樣本中 CHO  殘留 DNA。該方法具有速度快、 特異性高、  性能可靠且 檢測(cè)限可達(dá)到 fg 級(jí)別。
試劑盒組份：

表 1：試劑盒組份

試劑 裝量 貯存條件
CHO control DNA 40ul×1 管 -20oC
DNA dilution buffer 6ml ×1 瓶 -20oC
2×Taqman master mix (+UNG/ROX) 0.75ml ×2 管 -20oC
10×CHO qPCR mix 0.3ml ×1 管 -20oC
RNase-Free H2O 1.5ml×1 管 -20oC
規(guī)格 ：100  反應(yīng)
適用機(jī)型：
PRISM 7500 Real-Time PCR System (ABI)
StepOne Plus Real-Time PCR System (ABI)
LightCycler 480 (Roche)
AriaMX (Agilent Technologies)
CFX (BIO-RAD)

實(shí)驗(yàn)所需但試劑盒未包含材料：

? 1.5ml 無菌低吸附離心管
? 96 孔 qPCR  板
? 一次性手套
? 1000ul 、100ul 、10ul 無菌低吸附帶濾芯移液槍頭

實(shí)驗(yàn)操作過程：

一、 CHO DNA 定量參考品的稀釋及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

用試劑盒中提供的 DNA dilution buffer 將 CHO control DNA 進(jìn)行梯度稀釋， 稀釋濃度依 次為 300pg/ul 、30pg/ul 、3pg/ul 、300fg/ul 、30fg/ul 、3fg/ul 。具體操作如下：

1.將試劑盒中的 CHO control DNA 和 DNA dilution buffer 置于冰上融化，待完全融化后，

輕微振蕩混勻，簡(jiǎn)短快速離心。

2.取 6 支干凈的 1.5ml 離心管，分別標(biāo)記為 SD1 ，SD2 ，SD3 ，SD4 ，SD5, SD6。

3，SD1 管中加入 198ul DNA dilution buffer，其余管中分別加入 180ul DNA dilution buffer。

4,取 2ul  CHO  control  DNA 加入 SD1 管中， 然后渦旋振蕩混勻 5- 10s 后短時(shí)快速離心 5s，渦旋振蕩和快速離心各重復(fù) 3 次。

5,按表 2 依次進(jìn)行 6 次梯度稀釋操作，稀釋操作同步驟 4。

表 2. CHO control DNA 的稀釋

稀釋管	稀釋體積	濃度
SD1	2ul CHO control DNA+198ul DNA dilution buffer	300 pg/ul
SD2	20ul SD1+180ul DNA dilution buffer	30 pg/ul
SD3	20ul SD2+180ul DNA dilution buffer	3 pg/ul
SD4	20ul SD3+180ul DNA dilution buffer	300 fg/ul
SD5	20ul SD4+180ul DNA dilution buffer	30 fg/ul
SD6	20ul SD5+180ul DNA dilution buffer	3 fg/ul

二、加樣回收質(zhì)控 ERC 的制備

根據(jù)待測(cè)樣本的殘留量設(shè)置 ERC 中 CHO  control  DNA 的加樣濃度 (以制備加 45pg  CHO control DNA 的樣本 ERC 為例)，操作如下：

1，取待測(cè)樣本 100u，加至 1.5ml 干凈的離心管中；

2，加入 1.5ul SD2，混勻，標(biāo)記為樣本 ERC。

注：樣本 ERC 和同批待測(cè)樣本需一起進(jìn)行樣本前處理。

三、陰性質(zhì)控 NEG 的制備

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性質(zhì)控，操作如下：

1，取 100ul 樣本基質(zhì)溶液(或洗脫液)加至 1.5ml 干凈的離心管中標(biāo)記為陰性質(zhì)控 NEG。 注：陰性質(zhì)控 NEG 樣本和同批待測(cè)樣本需一起進(jìn)行樣本前處理。

四、 qPCR 反應(yīng)液的制備和加樣

1，根據(jù)所要檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測(cè)樣本數(shù)量，計(jì)算所需反應(yīng)孔數(shù)，一般做 3 個(gè)重復(fù)孔/樣。

反應(yīng)孔數(shù)=  (6 個(gè)濃度梯度+1 個(gè)無模板對(duì)照 NTC+1 個(gè)陰性質(zhì)控 NEG+待測(cè)樣本×2) ×3 注：待測(cè)樣本×2 是為了讓每個(gè)待測(cè)樣本檢測(cè)時(shí)都同時(shí)做樣本 ERC 。                  2，根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計(jì)算本次實(shí)驗(yàn)所需的各組分的所需總量以制備 pre-mix：

2×Taqman master mix=(反應(yīng)孔數(shù)+2) ×15ul    (含有 2 孔的損失量)

10×CHO qPCR mix=  (反應(yīng)孔數(shù)+2) ×3ul

RNase-free H2O=  (反應(yīng)孔數(shù)+2) ×2ul

3，各試劑置于冰上融化，振蕩混勻，按表 3 所示進(jìn)行加樣：

表 3.各反應(yīng)孔加樣示例

標(biāo)準(zhǔn)曲線	20ul pre-mix+ 10ul SD1/SD2/SD3/SD4/SD5/SD6
NTC	20ul pre-mix+ 10ul DNA dilution buffer
NEG	20ul pre-mix+ 10ul NEG
待測(cè)樣本	20ul pre-mix+ 10ul 待測(cè)樣本
ERC 樣本	20ul pre-mix+ 10ul ERC 樣本

注：加樣完成后每孔總體積為 30ul。